Cốt truyện phim mới lấy bối cảnh sau các sự kiện trong phần Underworld: Awakening. Ma cà rồng Selene (Kate Beckinsale) xinh đẹp buộc phải che giấu tung tích con gái Eve của mình trước sự săn đuổi của kẻ thù. Mệt mỏi vì phải chạy trốn liên tục, Selene và hai đồng minh thân cận quyết tâm kết thúc cuộc chiến dường như không có hồi kết giữa Ma cà rồng và Ma sói. Cùng lúc, hai ác nhân là Semira thuộc tộc Ma cà rồng và thủ lĩnh Marius của tộc Ma sói quyết tâm giành quyền kiểm soát dòng máu đang chảy trong người Selene để đạt được sức mạnh tối thượng.